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大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)

發(fā)布時間:2014-10-09瀏覽:1670次

           大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)的細(xì)胞會不可避免地存留少量異質(zhì)細(xì)胞一同生長.為了后續(xù)實驗結(jié)果的針對性和準(zhǔn)確性,一般都需要對培養(yǎng)物進(jìn)行純化。純化神經(jīng)元的方法有很多種,zui簡便及常用的是采用有絲分裂抑制劑阿糖胞苷來抑制異質(zhì)細(xì)胞的存活和生長。神經(jīng)元的分化增殖完成于胚胎期,大部分神經(jīng)元在出生后即為*的分裂后細(xì)胞,但其他細(xì)胞則仍然不斷地進(jìn)行分裂增殖,

使用有絲分裂抑制劑后,非神經(jīng)元的細(xì)胞生長會受到抑制及淘汰,神經(jīng)元由此得到純化

實驗材料:Hanks液,DMEM培養(yǎng)基10ml,有刻度吸管兩只,彎頭吸管兩只,無刻度吸管一只,新生乳鼠(24小時)0.05%胰酶,1%雙抗,10%胎牛血清,培養(yǎng)皿,小燒杯,空的離心管,鑷子,剪刀,酒精燈,酒精棉,

實驗前準(zhǔn)備工作:肥皂洗手,新吉爾滅擦手,開通風(fēng)柜,將吸管從套筒中取出放入各自對應(yīng)的試管內(nèi),將橡皮塞安裝到各自吸管上,酒精燈分別迅速灼燒,

1配液Hanks液近40ml加1%雙抗1ml,加完雙抗的小吸管留作計數(shù),在DMEM培養(yǎng)基中加10%胎牛血清(已配好,全部加入),從離心管取一滴碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值至溶液呈紫色,一離心管0.05%胰酶,

2.取材。乳鼠新生24小時。

3,洗滌剪碎,在培養(yǎng)皿中加入少許Hanks液洗滌,將乳鼠頭部用酒精棉擦拭消毒,在乳鼠頭部位置剪一個工字型切口,將皮膚顱骨沿著切口依次剪開剝離,取出大腦組織,并去除乳鼠的血管腦膜,用彎頭吸管將Hanks液與剝離干凈的腦組織移走到另一個干凈的培養(yǎng)皿中,用彎頭吸管洗走洗液,彎頭吸管將含有腦組織的Hanks移入到小燒杯中剪碎,每個組織塊近似一立方毫米,靜置后洗走上面的Hanks液,(吸取Hanks液時勿將下面的組織塊洗走),同樣方法再用Hanks液洗滌一次

4.酶解,加一離心管0.05%胰酶,將上述小燒杯中的組織液移入空置的離心管中,37攝氏度水浴10分鐘,觀察組織塊是否變小,靜置2分鐘,使組織沉淀下來,棄掉上請胰酶后,加DMEM培養(yǎng)基(全部倒入)來中和胰酶,吹散組織液

5.離心1200轉(zhuǎn)每分鐘,離心5分鐘,棄掉上清液,沉淀后加Hanks液吹散重懸組織液,用同樣的轉(zhuǎn)速和時間在離心一次,加*培養(yǎng)基3-4mL吹散,靜置1分鐘,以便消化大塊組織

6.計數(shù),取0.1ml離心后的細(xì)胞液加入苔盤藍(lán)染色,加樣搶加0.1微升與計數(shù)板計數(shù),同時剩余細(xì)胞液加入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)接種,標(biāo)注好組別和時間,培養(yǎng)細(xì)胞的名稱37攝氏度,二氧化碳培養(yǎng)箱中,下周實驗課觀察細(xì)胞培養(yǎng)情況。

7.計數(shù)結(jié)果:2.3×106 ml

注意事項:

  1. 實驗前保證乳鼠在冰塊內(nèi)冰凍數(shù)分鐘,頭朝下將乳鼠插入冰塊內(nèi),
  2. 玻璃腦膜血管時動作要迅速,以免乳鼠蘇醒
  3. 酒精燈應(yīng)放在離操作界面不遠(yuǎn)處,保證其溫度
  4. 用彎頭吸管吸取Hanks液時手腕旋轉(zhuǎn)
  5. 第二遍在小燒杯中用Hanks液洗時,要保證上請洗干凈,否則胰酶濃度將會減低
  6. *次水浴加熱時唔超過10分鐘,以免胰酶對組織產(chǎn)生損傷
  7. 吹打時避免大力以及吹打出氣泡,氣泡會導(dǎo)
  8. 致細(xì)胞破裂。吹打頻率可與秒表同步以保證每次操作的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
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