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ELISA方法操作步驟詳述

發布時間:2014-06-12瀏覽:1466次
 ELISA是酶聯接免疫吸附劑測定的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發展起來的一種免疫酶技術。
操作步驟 
方法一 
用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 
1.包被:用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃過夜。次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。 
2.加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。 
3.加酶標抗體:于各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小時,洗滌。 
4.加底物液顯色:于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘。 
5.終止反應:于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。 
6.結果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以“+”、“-”號表示。也可測O·D值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調零后測各孔O·D值,若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。 
方法二 
用于檢測未知抗體的間接法: 
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml, 
每孔加0.1ml,4℃過夜。次日洗滌3次。 
      ↓ 
加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔 中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照) 
      ↓ 
于反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml, 
37℃孵育30-60分鐘,洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。 
      ↓ 
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。 
elisa試劑盒
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